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對于細胞培養的同學(xué)們來(lái)說(shuō)，最不想遇到的就一定是污染，那各種各樣的細胞污染當中，例如細菌污染、真菌污染、病毒污染、支原體污染等等，其中支原體污染是這些污染重最難以分辨、去除的污染之一，接下來(lái)我們將全方位來(lái)對支原體污染的知識點(diǎn)進(jìn)行總結歸納。

支原體最早在1898年被發(fā)現，是沒(méi)有一類(lèi)沒(méi)有細胞壁、高度多形性、可以穿過(guò)0.22μm濾芯的最小原核細胞微生物。支原體大小一般在0.1-0.3μm之間，體型介于細菌和病毒之間，可以在無(wú)生命的培養基中自行生長(cháng)繁殖，不需寄生，一般附著(zhù)在皿瓶表面，對絕大多數抗生素有耐藥性。

根據研究數據表明，細胞培養過(guò)程中細胞支原體污染的發(fā)生率超過(guò)了60%，而且，在細胞陪支原體污染之后，期初是沒(méi)有辦法發(fā)現細胞明顯的形態(tài)變化，不會(huì )出現明顯的培養基渾濁變色，也不會(huì )出現明顯的細胞死亡，等發(fā)現異常的時(shí)候，細胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)多次傳代，甚至分不清是在哪一代保種是出現的污染，導致無(wú)法根治，只能從頭再來(lái)，所以，支原體污染是目前科研細胞培養中的一大難題。

實(shí)驗室中出現的支原體類(lèi)型絕大多數都是以下四類(lèi)：

口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無(wú)膽甾支原體。

實(shí)驗室中出現的支原體污染途徑主要有以下幾種：

1、細胞間交叉支原體污染；

2、科研人員的口腔皮膚，在科研過(guò)程中沒(méi)有按要求做好無(wú)菌防護，通過(guò)口腔呼出的氣液體或皮膚上沾染實(shí)驗操作臺導致口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體的污染；

3、工作環(huán)境及實(shí)驗器材污染，支原體在超凈臺或生物安全柜上存活的時(shí)間最多可以持續5天，這就意味著(zhù)在五天內有污染過(guò)的細胞在環(huán)境中進(jìn)行過(guò)操作，就可能會(huì )導致其余細胞也出現污染；

4、細胞培養試劑污染，精氨酸支原體以及無(wú)膽甾支原體主要來(lái)源就是胎牛血清以及新生牛血清，如果是豬源的胰酶，也可能存在豬鼻支原體；

5、滅菌不恰當，沒(méi)有徹底滅菌，沒(méi)有均勻滅菌，存在衛生死角等等也會(huì )導致支原體污染加劇。

在細胞培養中，我們第一步是需要在以下幾種情況下去重點(diǎn)觀(guān)察細胞是否存在支原體污染：

1、細胞生長(cháng)變慢(原先生長(cháng)時(shí)間2天長(cháng)滿(mǎn)的細胞，花了4天還沒(méi)有長(cháng)滿(mǎn));

2、細胞狀態(tài)變差(原先細胞狀態(tài)飽滿(mǎn)圓潤立體，逐漸變瘦變扁);

3、細胞邊界模糊(細胞相互粘連，邊界不清晰無(wú)法分辨);

4、細胞形態(tài)異常(細胞形態(tài)出現拉絲鋪展等情況);

5、在上述情況出現的同時(shí)，培養基上清液澄澈、換液后細胞狀態(tài)依舊無(wú)改變。

但是要確定存在支原體污染，還是需要通過(guò)以下幾種方法：

1、微生物培養法：取懷疑存在支原體污染的細胞上清樣，在特殊瓊脂培養基中培養，在37℃環(huán)境中孵育14天，陽(yáng)性情況會(huì )出現“煎蛋狀”菌落。

2、DNA熒光染色法:支原體中的DNA中主要以A-T為主，可以被Hoechst 33258染色，存在支原體污染的細胞染色后會(huì )明顯看到細胞周?chē)性S多大小相近的熒光小點(diǎn)或絲狀物，即表明存在支原體污染。

3、PCR法：通過(guò)擴增支原體16S核糖體RNA基因，可以檢測多種支原體，操作相較更快速、準確性也相對較高。